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反刍动物营养研究进展

2018-03-02 10:52:18 编辑: 作者:王之盛 薛白 王立志 彭全辉

前  言

    2017年反刍动物营养研究室共培养毕业硕士研究生5人,博士研究生 1人。毕业论文研究内容包括反刍动物饲料营养价值和饲用价值评定、反刍动物瘤胃微生物多样性研究等。在国内外期刊杂志已发表研究论文12篇,其中SCI论7篇,CSCD期刊论文5篇;在国内外学术会议提交学术论文3篇,做学术报告8次;技术培训 10余次。主办了《第二届中国反刍动物营养与饲养技术研讨暨乌蒙山片区产业扶贫培训会》,参加各级学术会议/论坛师生约 50人次。2017年反刍营养研究室共承担纵向项目9项,到账经费196万元。完成科研成果第三方评价1项。本文根据2017年反刍动物营养方向毕业的学位论文及已发表的部分研究性文章,将主要研究结果综述如下。


1胃肠道微生物多样性研究

1.1日粮中性洗涤纤维水平对山羊瘤胃微生物结构组成的影响

本研究旨在利用高通量测序技术研究饲粮中性洗涤纤维(NDF)水平对山羊瘤胃细菌结构组成的影响。选用6只山羊进行3×3拉丁方试验,依据饲粮NDF水平设低(LN组:NDF=35.01%)、中(MN组:NDF值=40.10%)和高(HN组:NDF值=45.16%)NDF水平共三个处理组。采集山羊瘤胃内容物,提取细菌总DNA,分别用细菌通用引物对和古菌专用引物对针对16S rRNA的高变区进行PCR扩增,扩增产物用Illumina HiSeq 250PE测序平台进行高通量测序后用QIIME等生物信息学软件对测序结果进行分析。结果表明:

山羊瘤胃液pH值在三个处理组间差异不显著(P>0.05),但随着日粮NDF水平的增加有升高趋势;HN组NH3-N浓度极显著低于LN组和MN组(P<0.01),LN组和MN组间的差异不显著(P>0.05);处理组间乙酸、丙酸、丁酸及总VFA浓度差异均不显著(P>0.05),乙酸/丙酸的比值有随着日粮NDF水平增加而升高的趋势,且LN组和HN组间的差异达到了显著水平(P<0.05)。

表1 饲粮NDF水平对山羊瘤胃发酵参数的影响

发酵参数

fermentation parameters 组别

LN组                                  MN组                         HN组

pH值 6.56±0.08 6.67±0.05 6.79±0.06

NH3-N浓度(mg/100 ml) 17.45±2.67 A 13.95±5.08 A 9.22±2.20 B

乙酸Acetate(mmol/L) 41.56±8.40 43.78±4.85 45.56±12.48

丙酸ProPionic(mmol/L) 17.48±4.33 13.89±2.30 13.28±4.79

丁酸Butyrate(mmol/L) 7.49±2.29 7.09±1.52 6.80±2.36

总VFA ( mmol /L) 66.53±13.86 64.76±6.32 65.65±18.78

乙酸/丙酸Acetate/Propionic 2.45±0.48 a 3.23±0.70 ab 3.62±0.74 b

注:同行肩标相同字母或未标字母的表示差异不显著(P>0.05),肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05),不同大写字母表示差异极显著(P<0.01),以下表相同。

表2饲粮NDF水平对山羊营养物质表观消化率的影响

营养成分表观消化率

apparent digestibility of nutrients 组别 Group

LN组                           MN组                                HN组

干物质 DM(%) 69.78±3.46 68.70±2.38 68.21±3.22

有机物 OM(%) 69.42±3.76 68.26±2.64 68.77±3.13

粗灰分 Ash(%) 72.15±1.55 71.75±1.45 67.20±4.52

粗脂肪 EE(%) 76.89±6.33 a 71.46±2.68 b 67.68±5.41 b

粗蛋白 CP(%) 70.42±3.41 69.62±2.01 68.18±3.52

中性洗涤纤维NDF(%) 42.05±5.93 a 45.03±3.74 a 52.21±6.38 b

从表2可以看出,处理组间山羊日粮DM、OM、CP表观消化率差异均不显著(P>0.05);LN组EE的表观消化率显著高于MN组和HN组(P<0.05);HN组NDF的表观消化率显著高于LN组和MN组(P<0.05)。

本次试验共得到了1125746条有效序列(Clean Data),平均每个样品含62541.44 ± 9024.13条。将有效序列进行聚类,共得到17198个OTUs。三个处理组间共享OTUs数为1012个,LN组与MN组间共享OTUs数为1197个,LN组与HN组间共享OTUs数为1083个,MN组与HN组间共享OTUs数为1083个(图1)。

 

图1  OTU维恩图

将本试验所得细菌有效序列在不同分类水平上进行物种注释,结果共得到23个门,44个纲,71个目,121个科,225个属。在细菌门水平上,三个处理组间物种相对丰度差异均不显著(P > 0.05)。拟杆菌门(Bacteroidetes),厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)在三个处理组中均为优势菌门,其次依次为黏胶球形菌门(Lentisphaerae),软壁菌门(Tenericutes)。而相对丰度很低的其余菌群则被聚为Others=13后用柱形图展示在图2中。

 

图2各个处理组的瘤胃细菌在门水平上的物种组成(丰度前十)

在属水平上,三个处理组的前两个优势属均依次为Prevotella_1和Rikenellaceae_RC9_gut_group。将225个属中相对丰度低于1%的属聚为Others=215后,各样本在属水平上的物种组成见图3。表3列出了在属水平上组间相对丰度有显著差异的细菌。Prevotellaceae_UCG-001、Prevotellaceae_UCG-003 、Ruminococcaceae_NK4A214_group、Ruminococcaceae_UCG-005和Ruminococcaceae_UCG-014的相对丰度呈现随NDF水平增加而升高的变化规律,且HN组显著高于其它两组(P<0.05),其它两组间无显著差异(P>0.05);SP3-e08和Lachnoclostridium_10的相对丰度呈现随NDF水平增加而降低的变化规律,且HN组显著低于其它两组(P<0.05),其它两组无显著差异(P>0.05);LN组中Succiniclasticum的相对丰度显著高于其他两组(P<0.05),其他两组无显著差异(P>0.05);MN组中Lysinibacillus、Bacillus和Phyllobacterium的相对丰度显著高于其它两组(P<0.05),Victivallis的相对丰度极显著高于其他两组(P<0.01),其它两组间无显著差异(P>0.05);LN组[Eubacterium]_ruminantium_group的相对丰度显著高于HN组,但与MN组比较无显著差异(P>0.05)。

 

图3各个样品瘤胃细菌在属水平上的物种组成

表3处理间相对丰度存在显著差异的属

属Genus   LN组                                MN组                         HN组

Prevotellaceae_UCG-003 1.76 ± 0.99 a 1.84 ± 0.63 a 3.33 ± 1.35 b

Prevotellaceae_UCG-001 1.16 ± 0.52 a 1.95 ± 1.44 a 3.01 ± 1.90 b

SP3-e08 0.26 ± 0.18 a 0.18 ± 0.12 a 0.04 ± 0.02 b

Ruminococcaceae_UCG-014 0.59 ± 0.40 a 0.75 ± 0.40 a 2.07 ± 1.78 b

Succiniclasticum 1.10 ± 0.95 a 0.40 ± 0.26 b 0.23 ± 0.11 b

Ruminococcaceae_NK4A214_group 0.29 ± 0.14 a 0.59 ± 0.24 ab 0.82 ± 0.51 b

Lysinibacillus 0.03 ± 0.03 a 0.19 ± 0.24 b 0.02 ± 0.01 a

[Eubacterium]_ruminantium_group 0.32 ± 0.15 a 0.27 ± 0.17 ab 0.13 ± 0.10 b

Bacillus 0.04 ± 0.03 a 0.22 ± 0.24 b 0.02 ± 0.01 a

Ruminococcaceae_UCG-005 0.02 ± 0.01 a 0.14 ± 0.11 b 0.16 ± 0.15 b

Lachnoclostridium_10 0.05 ± 0.03 a 0.05 ± 0.03 a 0.01 ± 0.01 b

Phyllobacterium 0.01± 0.00 a 0.06 ± 0.07 b 0.00± 0.00 a

Victivallis 0.06 ± 0.03 a 0.13 ± 0.07 b 0.02 ± 0.01 a

经统计,所有样品间共有35个共享细菌属。其中,相对含量在1%以上的主要共享菌属由高到低依次为Prevotella_1(37.29 ± 7.27%),Rikenellaceae_RC9_gut_group(7.30 ± 0.54%),Prevotellaceae_UCG-003(2.31 ± 0.88%),Lachnospiraceae_ND3007_group(2.19 ± 0.52%),Prevotellaceae_UCG-001(2.04 ± 0.93%),Succinivibrionaceae_UCG-002(1.90 ± 1.75%)、Selenomonas_1(1.79 ± 4.24%)、Ruminococcus_2(1.35 ± 1.77%)、Succinivibrio(1.20 ± 0.58%)、Ruminococcaceae_UCG-014(1.13 ± 0.81%)。这些菌属的比例占总菌属的56.5%。共享属聚类热图见图4,图中颜色越亮代表菌群的相对丰度越高。

 

图4 共享菌群在属水平上的聚类热图


本次测序的古菌共可分为3个门,5个纲,5个目,5个科,7个属。在门水平上,所有物种的相对丰度在三个处理组间差异均不显著(P<0.05)。广古菌门(Euryarchaeota)在三个处理组中均为优势古菌门,平均相对丰度达99.99±0.01%,虽然奇古菌门(Thaumarchaeota)和MCG被也被检测到了,但这两个门的相对丰度都非常低(图5)。

 

图5各处理组瘤胃古菌在门水平上的物种组成

各样品在属水平上的物种组成见图6。三个处理组的前三个优势古菌属均依次分别为Methanobrevibacter、Candidatus_Methanomethylophilus和Candidatus_Methanoplasma。其它各属的相对丰度都在1%以下。Methanobrevibacter的相对丰度呈现随日粮NDF水平的升高而增加的变化规律,且LN组与其它两组的差异达到了极显著的水平(P<0.01),其它两组间无显著差异(P>0.05);Candidatus_Methanomethylophilus和Candidatus_Methanoplasma的相对丰度随NDF水平的升高呈降低的变化规律,且LN组显著高于其它两组(P<0.05) ,其他古菌属两组间无显著差异(P>0.05);其余各菌属的相对丰度在三个处理组间差异均不显著(P>0.05)。用组间具有显著差异古菌属的相对丰度与日粮NDF浓度进行相关性分析,结果表明,日粮NDF浓度与Candidatus_Methanomethylophilus和Candidatus_Methanoplasma之间没有显著相关性,只与Methanobrevibacter呈极显著正相关(表4)。

 

图6各个样品瘤胃古菌在属水平上的物种组成

表4处理组间存在显著差异的古菌属及其与NDF消化率的相关性

属 Genus 古菌属相对丰度组间差异性分析

古菌属相对丰度与NDF水平相关性分析

LN组       MN组          HN组

R值

P值


Methanobrevibacter

52.50±22.05 A

84.22±10.68 B

87.88±11.35 B

0.630

0.005


Candidatus_Methanomethylophilus

27.84±24.13 a

12.89±7.73 b

10.87±10.45 b

-0.341

0.166


Candidatus_Methanoplasma

18.71±21.86 a

1.13±1.50 b

0.37±0.68 b

-0.624

0.106

三个处理组共享的古菌属只有4个,按照菌群相对丰度的高低依次是产甲Methanobrevibacter(74.86 ± 19.86%),Candidatus_Methanomethylophilus(17.20 ± 9.27%)、Candidatus_Methanoplasma(6.74 ± 10.38%)和Methanosphaera(0.22 ± 0.07%)。其中,Methanobrevibacter和Candidatus_Methanomethylophilus均为三个处理组的优势核心菌群且都属于广古菌门(Euryarchaeota)。


1.2日粮添加大豆油对育肥山羊生产性能和瘤胃微生物区系影响的研究

     本实验采用单因子试验设计,分别在基础日粮中添加0、1、2、3和4%(DM)的大豆油,各组日粮等能等氮。在体外发酵2、4、6、8、12、16、24、36、48小时采集发酵液样品,测定瘤胃发酵参数以及瘤胃液纤维降解酶活等指标来筛选日粮中最佳大豆油添加量。结果如下:日粮添加大豆油显著提高了丙酸浓度并降低乙酸/丙酸,其中3%大豆油添加组丙酸浓度最高(P<0.05),乙酸/丙酸最低(P<0.05)。添加大豆油降低了体外发酵NH3-N(P<0.05)和MCP浓度,其中3%大豆油添加组MCP浓度与0%大豆油添加组差异不显著(P>0.05),而4%大豆油添加组MCP浓度显著最低(P<0.05)。日粮添加大豆油对体外发酵pH无显著影响(P>0.05)。日粮添加1、2和3%大豆油与0%大豆油添加组产气量无显著差异(P>0.05),而4%大豆油添加组产气量显著下降(P<0.05)。日粮添加大豆油抑制了各纤维降解酶活性,各大豆油添加组中以3%添加组滤纸酶、羧甲基纤维素酶和木聚糖酶的活性最高,4%添加组果胶酶和木聚糖酶的活性最低(P<0.05)。以瘤胃发酵参数为评判指标选取3%的大豆油添加量进行动物试验。

选取12月龄、体重相近的健康公波杂山羊12只,随机分为2个组,设为基础日粮组和大豆油日粮组(3%,DM),进行42天的动物饲养试验,检测其生产性能和血生化指标,饲养试验结束后采集瘤胃液,检测瘤胃发酵指标,并采用16s DNA高通量测序检测瘤胃微生物区系。结果表明:日粮添加3%大豆油显著提高了山羊ADG,降低了料重比(P<0.05)(表5)。日粮添加3%大豆油使山羊血液脂类代谢相关的胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白浓度增加(P<0.05),蛋白代谢相关总蛋白和球蛋白的浓度增加(P<0.05)(表6)。日粮添加3%大豆油显著降低了山羊瘤胃乙酸浓度(P<0.05),显著提高丙酸浓度并降低乙丙酸比例(P<0.05),改变了发酵模式;显著降低了NH3-N浓度(P<0.05)(表7);并使山羊瘤胃中木聚糖酶的活性下降(P<0.05),降低了对纤维的降解能力(表8)。

表5 日粮添加油脂对山羊生产性能的影响

项目 组别

对照组 3%油脂组

初重kg 51.75±2.88 52.25±2.04

末重kg 57.42±2.60 59.42±1.74

日增重g/d 134.92±20.85a 170.64±28.83b

采食量kg 1.32±0.11 1.43±0.14

料重比 9.78±0.52b 8.38± 0.31a


表6 日粮添加油脂对山羊血液生化的影响

项目 组别

对照组 3%油脂组

葡萄糖mmol/l 3.63±0.40 3.91±0.36

总胆固醇mmol/l 2.83±0.40a 4.59±0.82b

甘油三酯mmol/l 0.33±0.06a 0.45±0.05b

高密度脂蛋白mmol/l 1.61±0.29a 2.49±0.20b

低密度脂蛋白mmol/l 1.13±0.35 1.50±0.46

极低密度脂蛋白mmol/l 0.03±0.01 0.04±0.01

尿素氮mmol/l 5.21±0.68 6.00±1.01

总蛋白g/l 63.96±2.41a 70.86±7.26b

白蛋白g/l 35.88±2.39 37.18±3.17

球蛋白g/l 28.07±2.12a 33.65±4.36b


表7 日粮添加油脂对山羊瘤胃发酵的影响

项目 组别

对照组 3%油脂组

pH 6.48±0.15 6.39±0.12

总挥发性脂肪酸mmol/L 53.86±2.93 49.87±5.16

乙酸mmol/L 39.48±2.28b 34.26±3.21a

丙酸mmol/L 10.01±0.95a 11.55±1.31b

丁酸mmol/L 4.37±0.70 4.06±0.69

乙酸/丙酸 3.97±0.39b 2.97±0.17a

微生物蛋白mg/100ml 29.08±2.99 25.79±2.29

氨态氮mg/100mL 26.30±1.97b 21.07±2.60 a


表8 日粮添加油脂对山羊瘤胃纤维降解酶活性的影响 μmol/(min.mL)

项目 组别

对照组 3%油脂组

果胶酶 1.66±0.09 1.68±0.12

滤纸酶 1.77±0.13 2.00±0.10

木聚糖酶 49.49±3.78a 42.93±3.00b

羧甲基纤维素酶 10.39±0.46 10.75±0.51


山羊瘤胃微生物在门水平优势菌群为拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门(Proteobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)等,在科水平优势菌群为普雷沃氏菌科(prevotellaceae)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)和拟杆菌目科(Bacteroidales BS11 gut group)等。日粮添加3%大豆油改变了山羊瘤胃微生物区系,显著提高了γ-变形菌纲中琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae),β-变形菌纲中的伯克氏菌科(burkholderiaceae)、丛毛单胞菌科(Comamonadaceae)(P>0.05),显著降低了多形杆状菌科和甲烷杆菌(Methanobacteriaceae)丰度(P<0.05)(表9)。

表9从门到属对照组和3%油脂组组间相对丰度差异显著的菌群分布

分类单元Taxa 组别

对照组 3%油脂组

门(Phylum) Bacteroidetes 89.08±2.77 72.20±14.10

Proteobacteria 2.23±1.15 22.55±11.67

Lentisphaerae 2.24±0.80 0.67±0.31

Euryarchaeota 0.28±0.19 0.01±0.01

纲(Class) Bacteroidia 89.02±2.77 72.17±14.12

Gammaproteobacteria 1.87±1.11 20.18±13.76

Lentisphaerae RFP12 gut group 2.24±0.80 0.67±0.31

Betaproteobacteria 0.20±0.09 0.40±0.15

Alphaproteobacteria 0.15±0.04 0.27±0.13

Methanobacteria 0.28±0.19 0.01±0.01

目(Order) Bacteroidales 89.02±2.77 72.17±14.12

Aeromonadales 1.67±1.14 19.63±13.47

*Lentisphaerae RFP12 gut group 2.13±0.76 0.59±0.31

Burkholderiales 0.16±0.07 0.33±0.12

*Gammaproteobacteria 0.11±0.04 0.36±0.21

Methanobacteriales 0.28±0.19 0.01±0.01

科(Family) Succinivibrionaceae 1.66±1.14 19.62±13.47

Bacteroidales S24-7 group 5.05±2.84 1.99±0.33

Uncultured 2.13±0.76 0.59±0.31

Bacteroidales RF16 group 1.58±0.68 0.77±0.17

Burkholderiaceae 0.09±0.05 0.20±0.06

Methanobacteriaceae 0.28±0.19 0.01±0.01

Bacteroidales UCG-001 0.17±0.07 0.10±0.03

Comamonadaceae 0.03±0.01 0.07±0.04

Chitinophagaceae 0.03±0.02 0.01±0.01

属(Genus) *Bacteroidales S24-7 group 4.97±2.85 1.94±0.31

Uncultured 2.13±0.76 0.59±0.31

*Bacteroidales RF16 group 1.57±0.67 0.76±0.16

Methanobrevibacter 0.28±0.19 0.01±0.01

Burkholderia 0.09±0.05 0.19±0.06

Bacteroidales UCG-001 0.17±0.07 0.10±0.03

注:若在统一水平上没有被分类的菌群,则用其属以上水平的菌名加左上角肩标“*”和其分类水平来表示。

1.3正常仔兔与ERE仔兔不同肠段微生物区系组成差异比较研究

本实验利用低纤维水平日粮诱导断奶仔兔产生ERE,通过高通量测序手段测定比较仔兔不同肠段内容物微生物区,测定盲肠发酵参数,从微生物角度探索导致仔兔的机理。结果表明:在健康家兔的盲肠内容物样品中共检测到63种(相对丰度>0.05%)不同的细菌属,在胃和小肠内容物中共检测到61种(Comamonas和脱硫单胞菌属未检测到或相对丰度<0.05%)。正常家兔不同肠段微生物组成差异较大。在胃内主要的细菌属(相对丰度>1%)是Ruminiclosididium(3.74%),拟杆菌属(3.93%),鞘氨醇单胞菌属(3.37%),Ruminococcaceae NK4A214组(3.10%),假单胞菌(2.71%),Lachnospiraceae NK4A136 group(2.30%),Allobaculum(2.29%),乳酸杆菌属(2.24%),瘤胃球菌属(1.85%)和Alistipes(1.85%)(图7)。 在小肠内主要的细菌属是Lachnospiraceae NK4A136 group (5.40%)(5.40%),Ruminiclosididium(4.73%),Ruminococcaceae V9D2013 group(4.61%),类杆菌(4.52%),假单胞菌(3.69%),Ruminococcaceae NK4A214 group(3.14%),志贺氏菌属(Escherichia-Shigella,2.78%) ,Ruminococcaceae UCG-014 group(2.54%),鞘氨醇单胞菌(2.12%)和瘤胃球菌(2.03%)。盲肠内主要的细菌属是Lachnospiraceae NK4A136 group(8.46%),Ruminococcaceae NK4A214 group(7.27%),Ruminococcaceae V9D2013 group (2.20%),Alistipes(3.84%),Ruminococcus(3.77%),Akkermansia(3.36%),Escherichia-Shigella(2.62%),拟杆菌属(2.60%),Subdoligranulum(2.41%)和Ruminococcaceae UCG-014 group(2.41%)。

 

图7.正常仔兔的胃、小肠和盲肠内容物微生物的组成及主要细菌属的相对丰度

在ERE仔兔中,在属类水平上,胃内主要细菌属是(鞘氨醇单胞菌属11.93%),拟杆菌属(8.42%),假单胞菌属(4.17%),肠杆菌属(4.12%)和梭菌属(3.83%)。小肠中主要的细菌属是拟杆菌属 (20.45%),Akkermansia(9.12%),Enterobacter(5.30%),Escherichia(4.39%)和Clostridium(3.12%)。在盲肠中主要的细菌属是拟杆菌属 (14.88%),Akkermansia(13.06%),Clostridium(6.53%),埃希氏菌(6.39%)和Rikenella(4.11%)(图8)。


 

图8.ERE仔兔的胃,肠和盲肠中最主要的属的相对丰度和微生物组成

PCoA图直观的展示了正常仔兔和ERE仔兔三个肠道微生物区系的差异。从图9A和B可知,正常组不同肠段内容物样品能够明显分开,而同一肠段6个样品能很好的聚在一起,表明仔兔三个肠道微生物区系呈现明显差异。此外,通过对正常组和ERE组同一肠段微生物区系对比分析发现,正常组不同肠段内容物样品和ERE不同肠段内容物样品能够明显分开,表明ERE显著改变了仔兔胃肠道微生物区系 (图9C、D和E)。

 

       

         


图9. PCoA图展示了正常组仔兔(A)和ERE仔兔(B)不同肠段(S=胃,I=小肠,C=盲肠)间微生物区系的组成差异以及正常仔兔与ERE兔不同肠道微生物区系组成


 

图10. 正常仔兔与ERE仔兔不同肠段内主要细菌门的对比柱状图


      通过对正常和ERE仔兔不同肠段对比分析发现,ERE显著改变了仔兔胃肠道微生物的组成,在门水平上,ERE显著降低了胃肠道拟杆菌门的相对丰度,显著提高了拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门的相对丰度(图10)。在属水平上,ERE显著提高了胃内Sphingomonas,Escherichia, Pseudomonas, Enterobacter 和Clostridium相对丰度,显著降低了Ruminiclostridium, Ruminococcaceae NK4A214 group, Pseudomonas, Lachnospiraceae NK4A136 group和 Allobaculum (图11A);ERE显著提高了小肠和盲肠内Bacteroides, Akkermansia, Escherichia, Clostridium, Enterobacter 以及 Rikenella的相对丰度,显著降低了小肠内Lachnospiraceae NK4A136, Ruminiclostridium, Ruminococcaceae V9D2013 group, Pseudomonas 和 Ruminococcaceae NK4A214 group以及盲肠内Lachnospiraceae NK4A136 group, Ruminococcaceae NK4A214 group, Ruminococcaceae V9D2013 group, Alistipes , Ruminococcus的相对丰度 (图11B和C)。此外,我们还发现益生菌如双歧杆菌和乳酸杆菌,以及丁酸菌生产菌在正常仔兔中表现出较高丰度,却在ERE仔兔中显著减少。此外潜在的毒素产生菌属Lysinibacillus(ES中为5.16% EI中的4.87,EC中的2.51%)在ERE组中也具有更高的数量。

 

 

 

图11. 正常仔兔与ERE仔兔的胃(A),小肠(B)和盲肠(C)内容物主要细菌属比较

      分析了盲肠细菌组成与盲肠发酵参数之间的关系(如果相关系数r>0.60且P <0.05,则认为在属水平细菌的相对丰度与盲肠内容物pH或主要VFA显著相关。)相关性分析结果表明,盲肠内容物中乳酸杆菌,双歧杆菌,普雷沃氏菌,Ruminococcaceae NK4A214 group和Alistipes属与TVFA的浓度呈正相关,与Rikenella,Bacteroides,Akkermansia,Clostridium,Lysinibacillus,Escherichia和Christensenellaceae R-7group 呈显著负相关。盲肠内容物中乙酸浓度与Alistipes和Ruminococcaceae NK4A214组呈正相关,与拟杆菌属和Akkermansia属呈显著负相关。丙酸浓度及其摩尔比例与Escherichia-Shigella,Lachnospiraceae NK4A136,乳酸杆菌,双歧杆菌和Alistipes属显著正相关。丁酸盐浓度及其摩尔比例与埃希氏菌,志贺氏菌,Lachnospiraceae NK4A136,乳酸杆菌,双歧杆菌,普雷沃氏菌和瘤胃球菌属呈显著正相关(图12)。


 

图12. ERE对盲肠发酵产物的影响(A),以及盲肠内容物主要的细菌属与盲肠发酵参数之间的相关性分析(B)。

2饲料营养价值评定

2.1不同类型酒糟营养成分组成差异的比较研究

分别从四川省(成都、宜宾、泸州和乐山)、青海省(海北、海东和合作)、云南省(昆明和临沧)、河南省(郑州)以及河北省(石家庄)等地共采集酒糟样品24个,分别为浓香型高粱酒糟、酱香型高粱酒糟、青稞酒糟、玉米酒糟和啤酒糟。对酒糟的营养组分、矿物元素以及抗营养因子等进行测定,然后采用康奈尔净碳水化合物和蛋白质体系(CNCPS)对不同类型酒糟的碳水化合物和蛋白质进行划分,结果如下:

由表10可以看出,不同类型酒糟新鲜样品的容重、pH值和初水含量差异显著。鲜玉米酒糟容重显著高于依次降低的鲜啤酒糟和鲜浓香型高粱酒糟(P<0.05)。鲜啤酒糟的pH值显著高于的鲜酱香型高粱酒糟(P<0.05);鲜酱香型高粱酒糟显著高于其他酒糟(P<0.05)。鲜啤酒糟的初水含量显著高于的鲜玉米酒糟(P<0.05);鲜玉米酒糟显著高于其他酒糟(P<0.05)。

不同类型酒糟DM差异不显著(P>0.05),其他各概略养分之间均存在显著差异。玉米酒糟的EE含量显著高于啤酒糟和酱香型高粱酒糟(P<0.05);啤酒糟和酱香型高粱酒糟显著高于浓香型高粱酒糟(P<0.05)。酱香型高粱酒糟和浓香型高粱酒糟的Ash含量显著高于依次降低的青稞酒糟和玉米酒糟(P<0.05),浓香型高粱酒糟的CF含量显著高于啤酒糟、 酱香型高粱酒糟和青稞酒糟(P<0.05);后三者CF含量显著高于玉米酒糟(P<0.05)。啤酒糟的CP含量显著高于青稞酒糟和玉米酒糟(P<0.05);青稞酒糟和玉米酒糟显著高于浓香型高粱酒糟(P<0.05)。玉米酒糟的NFE含量显著高于啤酒糟、酱香型高粱酒糟和浓香型高粱酒糟(P<0.05)。

不同类型酒糟纤维组分和淀粉之间也均存在显著差异。浓香型高粱酒糟的NDF含量显著高于啤酒糟和酱香型高粱酒糟(P<0.05);酱香型高粱酒糟显著高于玉米酒糟(P<0.05);。浓香型高粱酒糟的ADF含量显著高于依次降低酱香型高粱酒糟、啤酒糟和玉米酒糟(P<0.05)。浓香型高粱酒糟的ADL含量显著高于依次降低酱香型高粱酒糟、青稞酒糟和玉米酒糟(P<0.05)。玉米酒糟的Starch含量显著高于依次降低的青稞酒糟、酱香型高粱酒糟和啤酒糟(P<0.05)。

对不同类型酒糟蛋白营养成分分析可知,啤酒糟和酱香型高粱酒糟的NDIP含量显著高于浓香型高粱酒糟和青稞酒糟(P<0.05);浓香型高粱酒糟和青稞酒糟显著高于玉米酒糟(P<0.05)。浓香型高粱酒糟和酱香型高粱酒糟的ADIP含量显著高于依次降低的青稞酒糟和啤酒糟(P<0.05)。青稞酒糟的SCP含量显著高于玉米酒糟、浓香型高粱酒糟和酱香型高粱酒糟(P<0.05);后三者显著高于啤酒糟(P<0.05)。青稞酒糟的NPN含量显著高于玉米酒糟和浓香型高粱酒糟(P<0.05);玉米酒糟和浓香型高粱酒糟显著高于啤酒糟(P<0.05)。

表10不同类型酒糟营养成分含量(干物质基础)%

酒糟

类型 容重

(g/L) pH 初水 DM Ash EE CF NDF ADF ADL NFE CP NDIP ADIP SCP NPN Starch

浓香型高粱酒糟 445.96±

26.62c 3.65±

0.18c 58.42±4.17c 89.40±3.18 9.91±

2.04a 4.83±

2.29c 28.57±3.10a 53.43±5.29a 45.93±3.76a 15.35±2.11a 29.33±6.70b 16.75±1.64c 7.90±

1.17b 7.10±

0.99a 4.83±

1.81b 3.68±

1.41b 13.68±3.32bc

酱香型高粱酒糟 524.50±

15.61ab 3.94±

0.14b 56.47±6.18c 88.70±2.30 10.13±1.42a 7.95±

2.47b 17.12±2.06b 43.54±1.76bc 36.92±2.52b 10.40±0.67b 29.37±6.19b 24.12±2.30ab 10.81±1.24a 6.98±

0.81a 3.97±

1.28b 2.68±

0.88bc 12.20±3.07c

青稞酒糟 506.33±

12.46ab 3.59±

0.08c 59.91±1.72c 89.61±2.22 6.07±

1.57b 7.33±

1.36bc 15.58±1.95b 39.13±2.03cd 25.74±1.68cd 5.81±

0.98c 35.50±7.80ab 23.57±2.58b 7.40±

1.94b 3.13±

0.87b 8.67±

0.96a 7.13±

1.06a 16.74±0.79b

玉米酒糟 534.44±

25.89a 3.51±

0.06c 72.12±1.79b 89.70±3.23 1.97±

0.39c 13.85±1.71a 11.39±1.22c 36.08±1.60d 22.33±1.40d 2.96±

0.53d 43.13±1.65a 21.45±1.22b 4.34±

0.74c 2.11±

0.80bc 5.01±

1.62b 4.17±

1.34b 20.92±1.49a

啤酒糟 496.13±

26.83b 4.56±

0.25a 78.77±3.57a 91.10±1.34 3.91±

0.46c 10.21±1.62b 17.35±1.77b 46.16±1.94b 27.58±1.44c 5.77±

0.61c 32.29±2.56b 27.34±3.69a 12.42±1.52a 1.65±

0.60c 1.64±

0.34c 1.25±

0.32c 3.31±

0.85d

注:同列表格中小写字母不同表示差异显著(P<0.05),而未标字母或标有相同字母为无显著差异(P>0.05)。  

表11 不同类型酒糟碳水化合物和蛋白质组分含量

项目 浓香型高粱酒糟 酱香型高粱酒糟 青稞酒糟 玉米酒糟 啤酒糟

CHO(%DM) 68.50±4.19a 57.80±3.98b 63.03±4.77ab 62.73±0.22ab 58.54±4.83b

CA(%CHO) 13.43±8.30b 21.99±6.02b 22.78±6.36b 16.05±1.16b 36.61±2.68a

CB1(%CHO) 19.79±3.95c 20.96±4.18c 26.73±3.11b 33.35±2.49a 5.78±2.01d

CB2(%CHO) 12.87±8.05c 13.78±7.04c 28.25±0.70b 39.28±1.95a 33.93±2.90ab

CC(%CHO) 53.91±7.97a 43.27±3.00b 22.24±4.27c 11.32±1.99d 23.69±2.13c

CNSC(%CHO) 33.22±8.74b 42.95±7.95ab 49.51±4.29a 49.40±3.20a 42.39±2.02ab

PA(%CP) 22.06±8.30ab 11.40±4.37cd 30.29±3.61a 19.55±6.81bc 4.71±1.48d

PB1(%CP) 7.04±3.70a 5.41±3.09ab 6.58±2.23a 3.92±1.50ab 1.44±0.67b

PB2(%CP) 23.54±14.16c 37.83±13.60bc 32.05±4.84bc 56.26±11.84a 48.36±3.08ab

PB3(%CP) 4.74±2.83d 16.19±5.52b 17.85±5.54b 10.35±1.13c 39.59±2.17a

PC(%CP) 42.62±6.39a 29.17±4.45b 13.23±2.92c 9.91±4.07cd 5.90±1.51d

由表11可以发现,不同类型酒糟碳水化合物组分含量占CHO的比例差异较大。虽然酒糟在生产过程中原料大部分淀粉被降解,但仍含有不低于50%的CHO,最高可达74.46%。浓香型高粱酒糟的CHO含量显著高于啤酒糟和酱香型高粱酒糟(P<0.05)。啤酒糟的CA比例显著高于其他酒糟(P<0.05)。玉米酒糟的CB1比例显著高于依次降低的青稞酒糟和啤酒糟(P<0.05);酱香型高粱酒糟和浓香型高粱酒糟显著低于青稞酒糟(P<0.05),显著高于啤酒糟(P<0.05)。玉米酒糟的CB2比例显著高于青稞酒糟(P<0.05);青稞酒糟显著高于酱香型高粱酒糟和浓香型高粱酒糟(P<0.05)。浓香型高粱酒糟的CC比例显著高于依次降低的酱香型高粱酒糟和玉米酒糟(P<0.05);啤酒糟和青稞酒糟显著降低酱香型高粱酒糟(P<0.05),显著高于玉米酒糟(P<0.05)。青稞酒糟和玉米酒糟的NSC比例显著高于浓香型高粱酒糟(P<0.05)。

由表11可以看出,不同类型酒糟蛋白组分含量占CP的比例差异也较大。青稞酒糟的PA比例显著高于依次降低的玉米酒糟和啤酒糟(P<0.05)。浓香型高粱酒糟和青稞酒糟的PB1比例显著高于啤酒糟(P<0.05)。玉米酒糟的PB2比例显著高于酱香型高粱酒糟和青稞酒糟(P<0.05);浓香型高粱酒糟显著低于啤酒糟(P<0.05)。啤酒糟的PB3比例显著高于青稞酒糟和酱香型高粱酒糟(P<0.05);青稞酒糟和酱香型高粱酒糟显著高于依次降低的玉米酒糟和浓香型高粱酒糟(P<0.05)。浓香型高粱酒糟的PC比例显著高于依次降低的酱香型高粱酒糟、青稞酒糟和啤酒糟(P<0.05)。



表12不同类型酒糟矿物元素和抗营养因子含量(干物质基础)%

项目 浓香型高粱酒糟 酱香型高粱酒糟 青稞酒糟 玉米酒糟 啤酒糟

Ca 0.46±0.17a 0.58±0.22a 0.37±0.14ab 0.18±0.06b 0.41±0.10a

TP 0.32±0.13c 0.59±0.14ab 0.78±0.25a 0.44±0.14bc 0.62±0.25ab

Ca/TP 1.55±0.66a 0.96±0.24ab 0.49±0.17b 0.43±0.13b 0.80±0.56b

Fe 1247.00±372.31a 1541.93±361.55a 573.84±25.96b 140.16±24.46c 403.71±136.73bc

Cu 19.75±4.03cd 29.28±4.02b 22.77±3.30bc 13.72±4.92d 44.73±6.48a

Mn 181.81±33.36b 226.69±21.52a 118.21±33.64c 27.41±9.62d 101.95±8.72c

Zn 73.47±22.00c 103.21±4.81b 68.91±10.22c 66.99±17.85c 149.70±15.75a

Tannin 125.09±20.77ab 137.78±13.33a 90.86±8.40c 113.22±4.61b 47.71±9.47d

Si 28.84±3.36a 18.61±3.14b 13.28±2.14c 1.71±0.23e 6.45±0.99d

由表12可以看出,不同类型酒糟矿物元素和抗营养因子含量之间均存在显著差异。玉米酒糟的Ca含量显著低于浓香型高粱酒糟、酱香型高粱酒糟和啤酒糟(P<0.05)。青稞酒糟的TP含量显著高于玉米酒糟和浓香型高粱酒糟(P<0.05)。浓香型高粱酒糟和酱香型高粱酒糟的Fe含量显著高于依次降低的青稞酒糟和玉米酒糟(P<0.05)。啤酒糟的Cu含量显著高于依次降低的酱香型高粱酒糟和浓香型高粱酒糟(P<0.05);青稞酒糟显著高于玉米酒糟(P<0.05)。酱香型高粱酒糟的Mn含量显著高于依次降低的浓香型高粱酒糟、青稞酒糟和玉米酒糟(P<0.05);啤酒糟显著高于玉米酒糟(P<0.05)。啤酒糟的Zn含量显著高于酱香型高粱酒糟(P<0.05);酱香型高粱酒糟显著高于其他酒糟(P<0.05)。酱香型高粱酒糟单宁含量显著高于依次降低的玉米酒糟、青稞酒糟和啤酒糟(P<0.05)。浓香型高粱酒糟的Si含量显著高于依次降低的酱香型高粱酒糟、青稞酒糟、啤酒糟和玉米酒糟(P<0.05)。

2.2尼龙袋法与体外产气法评定饲料养分降解率的研究

达勒措等采用瘤胃尼龙袋法研究了十种饲料的营养物降解特性,得到饲料养分在各培养时间点的瘤胃动态降解参数,并据此计算出饲料养分的有效降解率。同时用体外产气法评定这些饲料的体外产气特性,得到相应时间点的产气量参数,并将每种饲料养分在各培养时间点的瘤胃动态降解参数与相应时间点的体外产气参数进行回归,得出用体外产气量数据预测饲料养分瘤胃降解率的预测模型。本研究还用体外产气参数预测了饲料的代谢能值和体外消化率。

尼龙袋法结果(表13)表明:所有的培养时间内,苜蓿中的DM和CP降解率最高(P<0.01),其次是酒糟。稻草的干物质降解率在所有培养时间内最低(p<0.01)。除了牛鞭草NDF消失率显著低于其它粗饲料外其它粗饲料在12到72小时之间NDF降解率没有显著变化(P>0.01)。粗饲料和精饲料的瘤胃降解参数和有效降解率分别见表13和表14。精饲料中DM有效降解率顺序为:玉米(66.78%)>豆粕(57.13%)>麸皮(50.36%)>棉粕(39.82%)>鱼粉(37.56%)。 CP有效降解率顺序为:麸皮(72.83%)>玉米(64.71%)>豆粕(59.41%)>棉粕(49.68%)>鱼粉(43.15)。

表13  五种粗饲料的瘤胃降解参数及有效降解率

项目 粗饲料 P value

苜蓿 稻草 酒糟 黑麦草 牛鞭草

a, %

DM 0.40±0.33b 0.02±0.21c 0.40±0.41b 0.32±0.12b 3.16±0.12a < 0.001

CP 0.58±0.45c 5.10±0.31b 6.20±0.69a 0.06±1.07e 0.12±0.93d < 0.001

NDF 0.35±0.22c 0.84±0.14b 0.20±0.45d 0.22±0.44d 3.77±0.37a < 0.001

b, %

DM 63.70±0.19a 64.58±0.94a 66.22±0.89a 53.99±0.16b 49.71±0.33b < 0.001

CP 62.68±0.71ab 35.41±2.45c 62.86±2.06a 54.66±0.87b 36.11±2.41c < 0.001

NDF 65.30±0.14a 57.02±0.36b 62.34±0.63ab 59.63±0.45ab 25.42±0.66c < 0.001

c, h-1

DM 6.97±0.33a 3.45±0.10d 6.02±0.47b 6.57±0.14a 5.61±0.05c < 0.001

CP 7.54±0.15a 3.25±1.30d 2.47±0.58e 5.57±0.45b 3.85±0.12c < 0.001

NDF 6.23±0.03a 6.69±0.15a 6.82±0.15a 6.87±0.19a 4.37±0.56b < 0.001

ED,%

DM 44.49±0.42a 34.04±0.20b 44.11±0.19a 37.00±0.25b 35.18±0.12b < 0.001

CP 45.00±0.39a 23.22±0.08c 34.08±0.84b 35.18±0.21b 20.12±0.13d < 0.001

NDF 43.95±0.12a 39.80±0.12a 43.06±0.20a 41.29±0.08a 18.64±0.18b < 0.001

R2

DM 97.62 99.47 97.76 99.51 98.31

CP 96.38 98.00 97.59 99.34 99.05

NDF 99.89 99.94 99.81 98.50 98.70

a-e在同一行中,不同上标字母表示差异显著


表14  不同培养时间下的精饲料DM、CP动态降解率(%)

培养

时间(h) 精饲料 P-value


玉米        麸皮        豆粕           棉粕          鱼粉    

DM

0 44.89±1.41a 27.12±0.35c 37.13±0.35b 24.53±0.25d 22.33±1.41e < 0.001

2 53.34±0.71a 32.07±0.71c 41.03±2.47b 27.13±0.71e 27.22±0.35d < 0.001

4 56.82±0.35a 36.43±1.06c 43.11±0.71b 33.82±0.71d 32.13±0.35e < 0.001

8 61.44±0.71a 47.44±1.41b 47.14±0.35c 35.13±1.06d 34.11±0.36e < 0.001

12 67.02±1.77a 56.32±1.41b 54.56±0.35c 39.22±1.77d 37.13±1.06e < 0.001

24 75.03±0.35a 61.03±0.35c 66.89±1.77b 47.23±1.77d 43.31±0.35e < 0.001

48 85.07±0.35b 63.22±0.71c 85.52±1.41a 54.12±0.35d 50.13±4.60e < 0.001

CP

0 35.41±0.71a 35.44±0.35a 33.52±0.69b 22.44±0.35d 25.12±3.53c < 0.001

2 42.53±0.35a 42.54±0.71a 37.01±1.77b 27.13±3.89d 31.44±0.35c < 0.001

4 51.44±0.72b 53.42±0.38a 41.02±1.06c 33.12±0.35e 38.12±0.35d < 0.001

8 58.03±1.06b 64.13±1.06a 44.12±0.35c 42.54±0.71d 40.92±2.12e < 0.001

12 67.02±0.68b 80.12±0.36a 66.13±0.36c 47.73±0.35d 44.03±0.33e < 0.001

24 77.13±0.66b 90.83±1.06a 75.32±0.35c 66.84±1.41d 48.43±1.06e < 0.001

48 87.85±0.71b 96.02±0.71a 85.12±1.77c 74.32±0.71d 54.33±1.06e < 0.001

a-e在同一行中,不同上标字母表示差异显著

粗饲料的体外产气法结果(表15)表明:从6h开始,苜蓿的产气率最高(P<0.01),其次是酒糟(P<0.01)。24到72 h黑麦草和牛鞭草间产气量无差异。

表15 五种粗饲料的累积产气量 (每mg底物产气量%)

时间 苜蓿 稻草 酒糟 黑麦草 牛鞭草 P值

2 1.18±0.07a 1.21±0.04a 0.66±0.05b 1.11±0.05a 0.64±0.03b < 0.01

6 5.14±0.04a 3.30±0.03c 4.37±0.02b 2.28±0.02d 1.73±0.03e < 0.01

12 8.54±0.02a 5.87±0.02c 7.79±0.04b 4.71±0.02d 3.78±0.02e < 0.01

24 15.82±0.03a 9.68±0.04c 13.64±0.05b 9.17±0.02cd 8.32±0.03d < 0.01

36 23.69±0.04a 12.77±0.04c 17.72±0.04b 13.57±0.01c 12.76±003c < 0.01

48 27.74±0.05a 14.26±0.03d 20.77±0.05b 16.86±0.01c 15.88±0.02c < 0.01

72 30.63±0.04a 17.91±0.03c 23.76±0.03b 19.70±0.13c 18.03±0.03c < 0.01

a (%) -0.97±0.80 0.44±0.20 -0.18±0.20 -0.01±0.40 -1.43±0.60 < 0.01

b (%) 36.07±2.90 21.73±0.80 27.40±0.70 28.82±2.80 22.64±3.70 < 0.01

c (%) 3.02±0.40 2.24±0.20 2.92±0.20 1.68±0.30 2.76±0.50 < 0.01

R2 (%) 98.93 99.71 99.90 99.14 98.97

a-e在一行中,上标方式的不同而不同

苜蓿除2小时外在其他培养时间点的产气量均高于其他饲料(P<0.05)。黑麦草自24小时开始与牛鞭草差异不显著(P>0.05)。牛鞭草的产气量最低,在48h,72h略高于稻草的产气量,但差异不显著(P>0.05)。黑麦草的快速降解部分显著高于其他饲料,其次为酒糟、稻草、苜蓿,牛鞭草的快速降解部分最低。

精饲料的体外产气法结果(表16)表明:豆粕开始产气较缓慢,自12h起产气量逐渐上升,高于鱼粉、麸皮和棉粕。玉米在4h-48h时间点的产气量都显著高于其他饲料。豆粕在2h-12h时间的产气量最低(P<0.05),在24h和48h产气量升高,显著高于麸皮、棉粕和鱼粉。棉粕与鱼粉的快速降解部分差异不显著;其中,玉米的快速降解部分最低。豆粕的慢速降解部分显著高于其他饲料(P<0.05).鱼粉和棉粕的慢速降解部分差异不显著(P>0.05)。精饲料产气量顺序为: 玉米>豆粕>鱼粉>麸皮>棉粕。

表16 五种精饲料的累积产气量(每mg底物产气量%)

时间 玉米 麸皮 豆粕 棉粕 鱼粉 P值

0 0.40±0.09 0.40±0.36 0.10±0.09 0.50±0.09 0.50±0.09 0.539

2 4.40±0.09a 3.00±0.09c 2.50±0.27c 4.00±0.09b 4.50±0.04a < 0.01

4 11.40±0.17a 5.40±0.17b 4.70±0.11c 6.00±0.28b 6.00±0.09b < 0.01

8 21.60±0.09a 9.20±0.18c 8.40±0.17d 9.00±0.30c 10.00±0.09b < 0.01

12 26.90±0.17a 12.40±0.17c 11.40±0.09d 12.00±0.30cd 13.50±0.11b < 0.01

24 31.70±0.23a 16.90±0.09d 20.60±0.17b 16.50±0.09e 18.00±0.22c < 0.01

48 37.90±0.17a 22.50±0.14c 32.10±0.17b 21.00±0.26d 22.50±0.17c < 0.01

a (%) -0.70±1.50d 0.60±0.40bc 0.30±0.20c 1.10±0.40a 1.00±0.50ab < 0.01

b (%) 37.91±2.00b 23.13±0.80c 47.70±1.70a 20.70±0.80d 22.10±0.80cd < 0.01

c (%) 10.1±1.40a 5.60±0.50c 2.30±0.10d 6.10±0.60c 6.60±0.60b < 0.01

R2 (%) 98.90 99.70 100.00 99.60 99.60

a-c在一行中,上标方式的不同而不同


将瘤胃降解率数据与产气量数据做相关分析,发现所有的相关关系均可拟合为三阶方程。在不同培养时间下十种饲料的产气量与它们各组分的降解率有很好的相关性。瘤胃降解率与产气量的三阶函数R2均大于95%。以上结果证明,在分析常用饲料的降解性能时,体外产气法可以代替尼龙袋法快速的得出其饲料的降解率。预测的体外有机物质消化率及代谢能:粗饲料中由高到低的顺序为:苜蓿>酒糟>稻草>黑麦草>牛鞭草。精饲料中由高到低的顺序为:玉米>豆粕>鱼粉>麸皮>棉粕。

 本研究将所有粗饲料的养分消失率和产气量建立了方程式(表17至表21),尼龙袋养分降解率和产气量之间具有很高的相关性(R2 > 0.95)。

表17   粗饲料DM降解率(y)与体外产气量(x,ml/mg)间的回归(y = ax3 + bx2 + cx + d)

粗饲料 a b c d R2 (%)

苜蓿 27.748 -19.883 5.5975 0.0002 99.53

稻草 -75.79 15.262 3.0085 -0.0018 98.81

酒槽 63.243 -33.311 7.1798 -0.0094 99.13

黑麦草 172.82 -71.746 10.299 -0.0226 98.27

牛鞭草 265.22 -95.395 11.577 -0.0164 99.50


表18   粗饲料CP降解率(y)与体外产气量(x,ml/mg)间的回归(y = ax3 + bx2 + cx + d)

粗饲料 a b c d R2 (%)

苜蓿 49.433 -31.011 6.9615 -0.0006 99.73

稻草 99.838 -34.35 5.0315 0.002 99.52

酒糟 103.18 -39.405 6.0073 0.006 99.66

黑麦草 86.426 -39.077 7.0381 0.0125 99.56

牛鞭草 118.7 -37.258 4.7185 0.0119 99.38


表19  粗饲料NDF降解率(y)与体外产气量(x,ml/mg)间的回归(y = ax3 + bx2 + cx + d)

粗饲料 a b c d R2 (%)

苜蓿 21.998 -17.319 5.341 0.0044 99.88

稻草 10.035 -22.471 6.9364 -0.0065 99.90

酒糟 33.584 -22.21 5.9428 0.0183 99.78

黑麦草 179.39 -73.712 10.56 0.0101 98.99

牛鞭草 119.11 -38.803 4.5689 0.0287 95.67


表20   精饲料DM降解率(y)与体外产气量(x,ml/mg)间的回归(y = ax3 + bx2 + cx + d )

饲料 a b c d R2 (%)

玉米 14.423 -6.9864 1.6431 0.4539 99.01

麸皮 -54.45 12.355 1.6097 0.2617 99.53

豆粕 -1.5218 1.1987 1.2782 0.3713 99.71

棉粕 2.9673 0.1497 1.2945 0.2364 98.61

鱼粉 29.167 -9.6989 1.9949 0.2127 98.95


表21  精饲料CP降解率(y)与体外产气量(x,ml/mg)间的回归(y = ax3 + bx2 + cx + d)

饲料 a b c d R2 (%)

玉米 11.23 -5.1805 1.7625 0.3525 99.34

麸皮 -73.691 17.709 2.4836 0.3437 99.64

豆粕 -20.457 5.9018 1.8538 0.3214 95.38

棉粕 -69.906 24.369 0.4677 0.2225 99.28

鱼粉 33.67 -14.021 2.8225 0.2342 98.46


体外产气法预测的粗饲料的消化率和代谢能结果:五种粗饲料中有机物体外消化率的范围在35%~50%,代谢能范围在3~6MJ/kg:苜蓿的IVOMD和ME最高,牛鞭草的有机物体外消化率和代谢能最低。粗饲料中由高到低的顺序为:苜蓿>酒糟>稻草>黑麦草>牛鞭草。

表22 五种粗饲料的有机物体外消化率和代谢能

粗饲料 苜蓿 稻草 酒糟 黑麦草 牛鞭草 P值

IVOMD,% 46.68±0.05a 37.17±0.05c 43.18±0.08b 36.54±0.03d 35.35±0.05e < 0.01

ME,MJ/kg 5.83±0.01a 4.01±0.01c 5.17±0.02b 3.89±0.01d 3.66±0.01e < 0.01

体外产气法预测的精饲料的消化率和代谢能结果:由表23可知,五种精饲料中有机物体外消化率的范围在40%~70%,代谢能范围在6~10MJ/kg:玉米的IVOMD和ME在所有饲料中最高,棉粕最低,但是显著高于粗饲料。麸皮和棉粕的IVOMD以及ME无差异。精饲料中由高到低的顺序为:玉米>豆粕>鱼粉>麸皮>棉粕。

表23  五种精饲料的有机物体外消化率和代谢能

精饲料 玉米 麸皮 豆粕 棉粕 鱼粉 P值

IVOMD,% 70.45±0.35a 48.45±0.14d 53.98±0.25b 47.88±0.14d 50.27±0.33c < 0.01

ME,MJ/kg 10.38±0.07a 6.17±0.03d 7.21±0.05b 6.04±0.03d 6.50±0.06c < 0.01


3低碳养殖技术

3.1cofD基因敲除对瘤胃反刍兽甲烷短杆菌甲烷生成的影响

本实验采用系列稀释滚管挑单菌落的亨盖特厌氧技术,利用优化的BRN培养基,对宣汉黄牛的瘤胃液样本进行多次系列稀释、富集、纯化培养,分离、筛选出纯的产甲烷菌,并对分离得到的菌株进行鉴定。结果表明:分离纯化出的产甲烷菌光学显微镜下呈平滑短杆状,直径0.7 μm左右,长为0.8~1.8 μm,单个存在或由2~4个菌体形成短链,在荧光显微镜下呈现蓝绿荧光(图13、图14)。

 

图13 反刍兽甲烷短杆菌(Mbr. ruminantium)的菌体形态

 

图14 反刍兽甲烷短杆菌(M. ruminantium)的荧光显微图

用甲烷菌16S rDNA基因的通用引物(84F-1340R)来扩增其DNA,得到了与目的片段长度、特异性一致的阳性条带。对扩增产物进行克隆测序,发现所测得的序列与NCBI库中反刍兽甲烷短杆菌(Methanobrevibacter ruminantium M1)16S rDNA序列(Accession:AY196666)相似性高达99%(图15)。采用Clustal进行比对,通过Mega软件进行UPGMA分析构建系统发育树,分离得到的产甲烷菌与Methanobrevibacter ruminantium M1的亲缘关系是100%(图16)。反刍兽甲烷短杆菌分离成功。


 

图15 16S rDNA的序列比对

 

图16基于16S rDNA序列的系统发育分析



对分离得到的反刍兽甲烷短杆菌进行培养结果表明,随着菌体的增殖甲烷产量逐渐增加,氢气消耗量逐渐增加,说明该菌能够有效利用H2生成CH4(图17、图18)。


 

图17反刍兽甲烷短杆菌的生长曲线图

 

图18 反刍兽甲烷短杆菌的甲烷差量和氢消耗曲线图

以分离得到的反刍兽甲烷短杆菌为研究对象,通过敲除辅酶F420合成所需的关键酶的编码基因cofD,采用插入失活的方法对cofD基因进行敲除,构建基因敲除载体pUC18-cofD-tet,然后电转化反刍兽甲烷短杆菌感受态细菌。结果表明:筛选出的cofD基因敲除型反刍兽甲烷短杆菌突变株的cofD基因表达量(图19)和CofD酶蛋白表达量(图20)均显著低于野生型(P<0.05),表明cofD基因敲除型反刍兽甲烷短杆菌菌株构建成功。

 

图19 cofD基因表达量验证

(注:空白对照,野生型反刍兽甲烷短杆菌;敲除型1和敲除型2,cofD基因敲除型突变菌株)

   

图20 CofD酶表达量验证


扩大培养比较cofD基因敲除型和野生型的反兽甲烷短杆菌的生长曲线,并分别在培养12,24,36,48和96h时终止培养,比较辅酶F420含量和甲烷产量差异。结果表明:cofD基因敲除后反刍兽甲烷短杆菌对数增长期(16h)低于野生型反刍兽甲烷短杆菌对数增长期(24h),cofD基因敲除后菌体的增殖幅度显著降低(图21)。野生型反刍兽甲烷短杆菌的最大菌体量和最大比生长速率均显著高于cofD基因敲除型(P<0.01),野生型反刍兽甲烷短杆菌的最大菌体量是cofD基因敲除型的2倍。cofD基因敲除后反刍兽甲烷短杆菌辅酶F420的含量显著降低,在36h、48h、96h,单位菌体量的辅酶F420含量分别降低了29%、59%、30%(P<0.01)(图22)。

 

图21 cofD基因敲除型与野生型反刍兽甲烷短杆菌生长OD曲线图

 

 

图22 不同时间点野生型和cofD基因敲除型反刍兽甲烷短杆菌的辅酶F420含量

(A:不同时间点菌液辅酶F420的含量;B:不同时间点单位菌体量的辅酶F420含量)


cofD基因敲除型反刍兽甲烷短杆菌的最大耗H2量和最大CH4生成量分别是野生型反刍兽甲烷短杆菌的14%和2%。cofD基因敲除降低了反刍兽甲烷短杆菌辅酶F420合成量和甲烷生成量(图23)。

 

图23野生型和cofD基因敲除型反刍兽甲烷短杆菌的甲烷产量和氢气浓度曲线图


4蛋白质营养

4.1提高蛋氨酸对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成调控通路的影响

      以乳腺上皮细胞系MAC-T细胞为试验材料,以在乳中测得的Lys:Met比例2.9:1为基础上通过提高Met添加量进行细胞培养。共3个试验组,以Lys:Met比例2.9:1为对照组(CON),提高Met添加量LM2.5组和进一步提高Met添加量LM2.0组为处理组,每个处理6个重复,每个重复一个孔,培养时间为12h。通过使用代谢组学(GC/MS)、转录组学(RNA-Seq)、qPCR以及Western blot平台及技术研究提高Met添加量对BMEC胞内代谢、基因转录表达、蛋白磷酸化水平以及酪蛋白基因CSN1S1和CSN2 表达量的影响。结果表明:提高Met显著促进了BMEC胞内Met、Lys、Arg、Phe以及BCAA的降解(P<0.05),降低了EAA的利用效率;代谢通路分析结果表明,提高Met添加量对Aminoacyl-tRNA biosynthesis代谢途径具有显著抑制作用(P<0.05)。提高Met添加量显著提高了氨基酸转运载体SLC3A2但是显著降低了氨基酸转运载体SLC7A5、SLC36A1、SLC38A2、SLC38A9和SLC43A1的mRNA表达量(P<0.05),与LM2.5组比较,进一步提高Met LM2.0组显著提高了SLC38A9和SLC43A1的mRNA 表达量(P<0.05)(图24)。

图24   提高Met添加量对奶牛乳腺上皮细胞氨基酸转运载体mRNA 表达的影响

在转录水平上,提高Met添加量LM2.5组导致了113个基因表达量发生变化,其中68个基因表达量显著上调(P<0.05),45个基因表达量显著下调(P<0.05);LM2.0组导致了71个基因表达量发生变化,其中38个基因表达量显著上调(P<0.05),33个基因表达量显著下调(P<0.05)。提高Met 添加量在转录水平上对蛋白合成相关通路p53 signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、protein kinase binding、regulation of phosphorylation、positive regulation of peptidyl-serine phosphorylation和PI3K-Akt signaling pathway具有显著调控作用,其中显著激活了mTOR pathway上游活性抑制通路p53信号通路(P<0.05)和显著降低了mTOR pathway活性激活通路PI3K-Akt的活性(P<0.05),并且显著降低了mTOR pathway下游HIF-1信号通路的活性(P<0.05),qPCR验证试验中提高Met显著降低了mTOR正调控因子RHEB、S6K1和EIF4E的表达量(P<0.05),从而表明提高Met抑制了mTOR通路的活性(图25)。

 

图25 提高Met添加量对奶牛乳腺上皮细胞mTOR pathway基因相对mRNA表达的影响。


提高Met添加量显著提高Akt但是显著降低了mTOR的磷酸化水平(P<0.05),说明Met主要通过蛋白翻译后磷酸化水平抑制mTOR通路活性,抑制了β-酪蛋白基因的表达(P<0.05),提高Met对酪蛋白合成的调控通路具有抑制作用(表24)。

表24提高Met对奶牛乳腺上皮细胞mTOR pathway信号蛋白表达和磷酸化状态的影响

Item Treatment

tts SEM P-Value1

CON LM2.5 LM2.0

Total protein

Akt 6.47 7.78 5.74 0.80 0.234

mTOR 0.15b 0.50a 0.44 a 0.07  0.027

4EBP1 0.72 0.94 1.43 0.26 0.187

S6K1 4.11 5.03 2.56 1.04 0.102

RPS6 7.38 9.55 5.16 2.04 0.347

EIF2α 1.40b 3.20ab 4.04a 0.60 0.025

EEF2 0.60 0.66 0.85 0.23 0.739

Phosphorylated protein

p-Akt 0.54b 1.00a 0.69b 0.08 0.005

p-mTOR 1.05b 1.84a 1.30b 0.11 0.005

p-S6K1 0.24b 0.39a 0.12c 0.05 < 0.001

p-RPS6 1.82 2.29 1.69 0.36 0.481

p-EIF2α 0.76 0.91 0.84 0.20 0.872

p-EEF2 9.63 11.82 13.22 2.65 0.638

Ratio

p-Akt/Akt 0.08b 0.13a 0.12a 0.01 0.002

p-mTOR/mTOR 7.18a 3.81b 3.21b 0.52 0.004

p-4EBP1/4EBP1 2.11 1.32 1.54 0.27 0.151

p-S6K1/S6K1 0.06 0.08 0.05 0.01 0.135

p-RPS6/RPS6 0.25 0.29 0.37 0.04 0.234

p-EIF2α/EIF2α 0.61 0.57 0.27 0.19 0.429

p-EEF2/EEF2 18.2 19.9 17.4 3.03 0.847


4.2提高BCAA对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白合成调控通路的影响

    本试验采用相同对照组,分别以其中Lys:Ile=1.45:1、Lys:Val=1.23:1和Lys:Leu=0.85:1比例中的Ile、Val和Leu添加水平为对照,在此基础上进一步提高BCAA(Ile、Val和Leu)的添加量进行细胞培养。试验共4个组分别为CON、提高Ile组(LI1.12)、提高Val组(LV1.12)和提高Leu组(LL0.78),每个处理6个重复,每个重复一个孔,处理时间为12h。 通过使用代谢组学(GC/MS)、转录组学(RNA-Seq)、qPCR以及Western blot平台及技术研究BCAA对乳蛋白合成的影响及调控机理。结果表明:提高Val添加剂量(LV1.12)显著提高了EAA(His、Met、 Ile 和 Leu)、NEAA(Gln、Glu、 Ser、 Gly 和Asp)浓度以及磷酸、尿酸、N-乙酰谷氨酸和果糖的浓度(P<0.05),但是显著降低了葡萄糖-6-磷酸的浓度(P<0.05),LI1.29组提高MAC-T胞内AA(Pro,Leu,Asp,Glu和Gln)的浓度以及尿酸、N-乙酰谷氨酸、乙醇酸的浓度(P<0.05),显著降低了丙酮酸、戊二酸、磷酸、核糖-5-磷酸、3-磷酸甘油、1,2,4-苯酚和3-羟基丙酮酸的浓度(P<0.05),LL0.78组提高MAC-T胞内磷酸、尿酸和琥珀酸的浓度(P<0.05) ,显著降低了葡萄糖-6-磷酸、丙酮酸、磷酸和富马酸的浓度(P<0.05)(图26 )。

 

图26 提高BCAA对奶牛 乳腺上皮细胞胞内重要代谢分子VIP分析


代谢通路分析发现提高BCAA对涉及AA代谢的BCAA合成代谢通路、Ala-Asp-Glu代谢通路、Cys-Met、Glu-Gln代谢通路、Gly-Ser-Thr代谢通路和Arg-Pro代谢通路代谢通路具有调控作用(图27)。

 

图27  提高BCAA对奶牛乳腺上皮细胞代谢通路的富集分析


Leu显著增强了AA转运载体(SLC3A2,SLC7A5,,SLC36A1,SLC38A2和SLC38A9)的基因表达量(P<0.05),Val显著增强了BMEC胞内AA转运载体(SLC3A2和SLC38A9)的基因表达量(P<0.05),Ile显著增强了SLC3A2(P<0.05),但是显著降低了(SLC7A5,,SLC38A2和SLC38A9)的基因表达量(P<0.05),BCAA对氨基酸转运载体表达量调控强弱顺序为Leu> Val > Ile(图28)。

 

图28  提高BCAA添加量对奶牛乳腺上皮细胞氨基酸转运载体mRNA 表达的影响


在转录水平上,提高Val导致了951个差异表达基因,提高Leu导致了157个差异基因,提高Val和Leu对蛋白合成相关信号调控通路mTOR pathway和PI3K-Akt pathway、翻译起始因子活性、蛋白磷酸化酶结合和磷酸化调控通路都具有显著影响,其中提高Val上调了mTOR通路活性,提高Leu显抑制了mTOR通路的活性(表 25)。


表 25  Pathway 显著性富集分析结果

Pathway DEGs in pathway P-Value

CON vs LV1.12

p53 signaling pathway 10 0.004456

mTOR signaling pathway 9 0.004759

Regulation of actin cytoskeleton 19 0.007718

PI3K-Akt signaling pathway 26 0.013874

FoxO signaling pathway 12 0.036344

CON vs LL0.78

ECM-receptor interaction 6 0.000636

Regulation of actin cytoskeleton 6 0.00278

Amino sugar and nucleotide sugar metabolism 3 0.0567

PI3K-Akt signaling pathway 7 0.0591

Apoptosis 3 0.0886


蛋白磷酸化水平上,提高Val显著提高了 Akt、mTOR、S6K1和RPS6(P<0.05),并降低了EIF2α的磷酸化水平(P<0.05),增强了mTOR pathway的活性(P<0.05)。提高Ile显著提高了mTOR、4EBP1、RPS6并降低了EIF2α和EEF2的磷酸化水平(P<0.05),增强了mTOR pathway的活性,提高Leu显著降低mTOR的磷酸化水平(P<0.05),对mTOR pathway活性存在抑制作用(表26)。


表26 提高BCAA添加量对奶牛乳腺上皮细胞mTOR pathway信号蛋白表达和磷酸化状态的影响

                                        Treatments


CON LI1.29 LV1.12 LL0.78            SEM                P- Value

Total protein

Akt   6.47ab 10.11ab 3.96b 13.24a 2.67 0.158

mTOR   0.15   0.27 0.11 0.28 0.10 0.108

4EBP1   0.72b   1.83a 1.94a 1.26ab 0.28 0.006

S6K1   4.14a   1.75bc 1.91b 1.01b 0.34 < 0.001

RPS6   7.38a   8.58ab 3.61b 3.48b 1.02 < 0.001

EIF2α   1.40c   7.29b 12.58a 10.28a 1.03 < 0.001

EEF2   0.60b   1.08a 0.88b 0.85b 0.15  0.150

Phosphorylated protein

p-Akt             0.54b 0.61ab 0.50b 1.35a 0.26 0.155

p-mTOR 1.04c 3.41a 0.11b 1.48c 0.14 < 0.001

p-4EBP1 1.50c 6.40a 6.33ab 3.30bc 1.05 0.007

p-S6K1 0.24a 0.08b 1.91a 0.10b 0.02 < 0.001

p-RPS6 1.82b 4.39a 3.61a 2.21b   0.38 < 0.001

p-EIF2α 0.76a 0.69bc 12.58c 0.75ab   0.09 0.02

p-EEF2 9.63b 9.76b 0.88a 16.52ab   2.94 0.04

Ratio

p-Akt/Akt 0.08bc 0.06c           0.14a 0.10 b 0.01 < 0.001

p-mTOR/mTOR 7.18c 12.81b 23.98 a 5.36c 0.83 < 0.001

p-4EBP1/4EBP1 2.11b 3.57a 3.44ab 2.54ab 0.48 0.018

p-S6K1/S6K1 0.06b 0.05b              0.09a 0.10a 0.01 0.026

p-RPS6/RPS6 0.25c 0.53b             1.29a 0.61b   0.08 < 0.001

p-EIF2α/EIF2α 0.55a 0.09b            0.04cd 0.07b 0.02 < 0.001

p-EEF2/EEF2 18.22ab 9.04b            26.79a 20.21a 3.13  0.006


提高BCAA显著提高了α-S1酪蛋白基因的表达量(P<0.05),提高Val显著促进了β-酪蛋白的基因表达(P<0.05),但提高Ile显著降低了β-酪蛋白的基因表达(P<0.05)。提高Val对酪蛋白合成的调控通路活性具有增强作用(图 29 )。

 

图 29  提高BCAA对奶牛乳腺上皮细胞酪蛋白基因CSN1S1和CSN2表达的影响。


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